实验原理

在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，萤火虫荧光素酶可以催化萤火虫荧光素生成氧化荧光素，在荧光素被氧化的过程中，会产生光信号。

在氧气存在的条件下，海肾荧光素酶可以催化腔肠素氧化成腔肠酰胺，在腔肠素氧化的过程中也会产生光信号。

亚科因双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：KTA8010）

适用样本：细胞、原生质体、植物叶片

适用仪器：发光检测仪或多功能酶标仪

检测原理

通常把目的基因的转录调控元件或5'-启动子区克隆在Luciferase的上游，或把3'-UTR区克隆在Luciferase的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞。

用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测荧光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。

海肾荧光素酶更多地被用作检测转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒先以萤火虫荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入抑制萤火虫荧光素酶催化的物质，同时加入腔肠素检测海肾荧光素酶活性，实现双荧光素酶报告基因检测。

实验流程

因因给大家准备了实验流程图，步骤直观易懂，新手也能快速上手哦！

高清彩色流程图随产品说明书附赠哦，做实验超方便！

常见问题

一、萤火虫或海肾的发光数值非常低

正常表达水平下，荧光值的数量级应在10⁴-10⁷数量级左右，导致数值低主要有以下几个原因及解决方案：

转染效率低：

1、确保细胞状态良好；
2、可以选择过表达的荧光蛋白质粒作为阳性对照；
3、转染试剂的选择至关重要。

操作不当：

检测前将试剂平衡至室温，加工作液前先设置好仪器参数及确认工作状态，并在仪器旁边快速加入工作液以确保在底物半衰期内进行检测。如果检测样本数量较多，可以分批加入分批检测。

裂解不充分：

1、细胞培养时间不宜过长，最好不超过36h，培养时间过长的话，细胞难裂解；
2、裂解液的量要足以充分裂解细胞；
3、实验对象为烟草叶片时，可在EP管中加入液氮和预冷的小钢珠对叶片进行研磨，使裂解更充分。

底物失效：

1、底物保存的时候要避光低温分装保存，尽量减少冻融次数；
2、反应工作液建议现配现用。

二、复孔差异大

双报告基因检测系统较为灵敏，检测结果受多种因素的影响，因此，一般设置3个或3个以上的复孔。复孔之间有差异是正常的，差异在同一个数量级可以接受。

差异过大时建议如下：

裂解后建议离心取上清，保证样本均一性。

保证加样的准确性，检测样本数量较多，可以分批加入分批检测。

双荧光素酶报告基因检测注意事项

由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行检测。较高的温度会导致信号强度增加，但信号稳定性较低，因此建议操作环境温度不超过25℃。

高活性的荧光素酶能够更快速地催化底物发光，产生大量的光信号。然而，这种快速反应往往会导致发光信号的半衰期缩短。

为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，每个样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入Firefly Luciferase Solution。

检测时需使用全黑色的96孔板，防止相邻孔的干扰。

萤火虫荧光素酶催化生物发光最强波长为560nm，海肾荧光素酶催化生物发光最强波长为480nm。（检测时仪器不需要设置固定波长，直接选择化学发光检测全波长即可）Renilla Luciferase Substrate 易挥发，注意密封低温保存。

产品优势

发光信号强
性能比肩国际主流品牌；灵致度高，可精准检测弱启动子表达及miRNA靶基因验证。

稳定性优异
本产品反复冻融多次后，检测发光信号强度与猝灭率均无明显变化。萤火虫发光信号半衰期长约30-40分钟，稳定性优异。

猝灭效果好
海肾荧光素酶检测工作液对荧火虫信号的淬灭率超过99.9%；有效消除交叉干扰，提升海肾信号检测的准确性和可靠性。

结果展示

信号强度及反复冻融效果

图1、A.使用本品（货号KTA8010）与国外知名品牌P同类试剂盒进行发光信号强度对比检测，结果显示我司产品的萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶发光强度均表现出更好的检测信号；

B.将本品反复冻融多次，检测对萤火虫信号、海肾信号和萤火虫淬灭率的影响，结果显示信号强度几乎不受影响，稳定性极高。

发光信号稳定性

图2、 使用本品（货号KTA8010）与国外知名品牌P同类试剂盒进行萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶化学发光稳定性对比检测，

结果显示：本品的发光稳定性可媲美P品牌，其中萤火虫荧光素酶的信号半衰期约30min，海肾荧光素酶的信号半衰期约180s，能够更好地满足日常使用需求。