Annexin V-FITC/PI 法是目前实验室里最常用的细胞凋亡检测方法之一，门槛不高、灵敏度好，但真要做出一张“漂亮”的流式图，却没那么简单。

接下来可以跟着因因一起看一下做Annexin V实验时常遇到哪些问题以及如何进行解决呢。

检测原理

细胞凋亡的早期阶段，细胞膜脂质双层的对称性丧失，原本位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS） 会从细胞膜的内表面翻转到外表面，暴露于细胞外环境。Annexin V 是一种分子量约35–36 kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力，能特异性结合在暴露于膜外侧的PS上。通过将Annexin V与荧光素（如FITC）偶联，即可用流式细胞仪或荧光显微镜检测到早期凋亡细胞。

与此同时，碘化丙啶（PI） 是一种DNA结合的红色荧光染料，无法穿透完整细胞膜，只能进入晚期凋亡或坏死细胞，与细胞核内的DNA结合后发出红色荧光。

将Annexin V-FITC和PI联合使用，可以同时区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞以及机械损伤细胞，实现对不同凋亡阶段细胞的准确识别。

原理速记口诀：PS外翻是早凋信号，Annexin V来抓；膜破了PI才进去，晚凋坏死靠它标。

双染结果的细胞类型判定标准：

Annexin V⁻/PI⁻：活细胞（未发生凋亡，膜完整）

Annexin V⁺/PI⁻：早期凋亡细胞（PS外翻，但膜仍完整）

Annexin V⁺/PI⁺：晚期凋亡/坏死细胞（PS外翻且膜已受损）

Annexin V⁻/PI⁺：机械损伤细胞或裸核（膜严重破坏，但无PS特异性外翻）

实验结果怎么看？

流式细胞仪检测完成后，我们通常会在二维散点图（FITC通道为X轴、PI通道为Y轴）上看到四个象限，分别对应不同状态的细胞群。

结果判读速记：总凋亡率 = Q2 + Q3（早期凋亡 + 晚期凋亡/坏死）。左上角Q1群体越少，说明实验操作中机械损伤越少，样本质量越好。

早期凋亡细胞显示仅细胞膜绿色荧光，死细胞显示细胞 核红色荧光和细胞膜绿色荧光，活细胞几乎没有荧光。

常见问题及解决方案

1. 细胞碎片过多

可能原因：胰酶消化过度；机械损伤严重；缓冲液稀释不当。

解决方案：

（1）优化消化时间，避免细胞长时间暴露于胰酶。比较难消化的细胞可以分批次消化，避免先消化下来的细胞被过度处理。

（2）吸取液体和吹打细胞时务必轻柔，吸取时枪头紧贴管壁，避免产生气泡。

2. 阴性对照组凋亡率过高

可能原因：细胞本身状态差（如细胞浓度过高导致培养液迅速消耗而引起饥饿导致的凋亡）；染色前操作损伤过大；染色时间过长。

解决方案：

（1）确保细胞处于对数生长期、状态良好，实验前做细胞活力检测。

（2）细胞密度适中，避免过密培养导致自发性凋亡。

（3）严格控制染色孵育时间。

（4）建议设置生物学对照（未做任何处理的细胞），辅助判断实验操作对凋亡率的影响。

3. 分群不明显

可能原因：荧光补偿调节不当；细胞状态不佳；细胞数量过多或过少。

解决方案：

（1）正确调节FITC和PI双通道的补偿。FITC和PI的发射光谱存在重叠，相邻探测器会检测到彼此的荧光信号，因此必须进行光谱重叠校正。

（2）在流式软件（如FlowJo、BD FACSDiva）中手动调整补偿值，确保阳性群体与阴性群体清晰分离。

（3）数据分析时可以去粘连，减少黏连信号干扰。

（4）上机时先用FSC/SSC圈选活细胞群，排除碎片后再分析Annexin V/PI双染信号。

4. 凋亡率异常低

可能原因：诱导条件不佳（药物浓度或处理时间不足）；贴壁细胞只收了消化下来的细胞，未收集漂浮的凋亡细胞；胰酶中含有EDTA干扰了Annexin V与PS的结合。

解决方案：

（1）优化诱导条件，可先用阳性对照验证试剂盒有效性。

（2）收集细胞时务必同时收集上清中的漂浮细胞，这部分细胞往往是已经发生凋亡的细胞，与贴壁消化下来的细胞合并后一起离心，否则会严重低估凋亡率。

（3）贴壁细胞尽量使用不含EDTA的胰酶进行消化。如果必须用含EDTA的胰酶，终止消化后务必将细胞洗涤干净，尽量去除EDTA，因为EDTA是Ca²⁺的螯合剂，会抑制Annexin V与PS的结合。这是新手最容易踩的坑之一，也是很多低凋亡率结果的根源所在。

5. 信号弱或无信号

可能原因：试剂失效；染料加入量不足；结合缓冲液中缺少Ca²⁺；或误用PBS替代Binding Buffer。

解决方案：

（1）使用新鲜试剂，Annexin V染料对光敏感，需避光保存。

（2）按产品说明书准确加入推荐量的染料。

（3）务必使用含Ca²⁺的Binding Buffer重悬细胞，不要用PBS替代，这是保证Annexin V有效结合的关键。

（4）如果已经使用了含EDTA的胰酶，务必彻底清洗后再用Binding Buffer重悬。

6. 结果重复性差

可能原因：每次实验的操作步骤不一致；所用细胞代次不同（高代次细胞可能发生表型漂移）；流式细胞仪状态不稳定。

解决方案：

（1）建立标准化的操作流程（SOP），每次实验使用相同代次的细胞。

（2）定期校准流式细胞仪，保持仪器状态稳定。

（3）每次实验均设置完整的对照，并至少进行三次生物学重复。

对照设置（非常重要！！！）

每次Annexin V-PI双染实验，必须设置以下对照管，以确保电压调节和补偿计算的准确性。设置对照管时，务必使用确定有凋亡的细胞作为单阳对照样本，因为调节补偿需要有足够的阳性信号：

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